于是“冷解离”的解决方案开始被人们关注，在4℃甚至更低的温度条件下，细胞的转录活性处于休眠状态，因此细胞内的基因表达就被“冻结”了（Freezing），这就解决了由于解离环境引入的基因表达模式改变的问题。“冷解离”要求酶在低温条件下依然保持较高的活性，从嗜冷微生物中纯化的蛋白酶（喜马拉雅冰川常驻细菌地衣芽孢杆菌中分离的丝氨酸蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶 A）满足了“冷解离”对于酶的要求。
从已经报道的研究中发现，像肾脏、脑、肝、实体瘤等类型组织，研究人员更青睐于采用“冷解离”的方式分离细胞进行单细胞研究。随着对“热解离”和“冷解离”方式的优劣势的逐步了解，研究人员根据不同的目的，将会在更多组织类型上选择最优的解离方案。
我们解析了一些案例，比较了不同组织“热”与“冷”解离方案对细胞数据真实性的影响，方便大家更加清晰地了解两种方式的优劣势。
Susanne C, et al. 2017在《Nature Methods》杂志的《Correspondence》栏提出，组织解离实验中，沿用的经典热酶解法得到的细胞，存在转录偏好性，一些即时早期反应基因（Immediate-Early Response Genes，IEGs，如Fos、Jun或其他激活蛋白相关基因）、转录因子或者热休克蛋白（Heat-shock Proteins，HSPs）会在一些类型的细胞中非自然状态表达。这些基因的表达是受到高温条件下（30-37℃）酶孵育刺激而产生的，也就是说经典的热酶解法会引入孵育环境造成的基因表达差异。作者表示，一些已发表的转录组学研究也发现这个问题，可能需要重新做出解释。
作者引出上面的结论所研究的对象是肌肉中的卫星细胞（Satellite Cells，SCs），从Pax7nGFP小鼠未损伤的胫骨前肌中分离SCs进行了单细胞测序。组织分离采用了广泛使用的热解离方案（37℃酶孵育），经过FACS富集SCs，通过scRNA-seq在数据中确定了两个亚群，分析发现亚群2的细胞中表达了高水平的即时早期基因、Socs3和热休克蛋白(HSPs)（图a）。
为了验证这两个亚群的存在，作者对Pax7nGFP小鼠肌肉的冷冻切片进行了单分子RNA荧光原位杂交实验(smFISH)，使用针对亚群2特异性基因Fos和Socs3设计了探针，却显示在冷冻切片中无法检测到Fos和Socs3的表达（图b）。
然而，作者在经过热解离得到的SCs，或者热解离后经过FACS富集得到的SCs中均检测到Fos的表达。这表明SCs的分离过程诱导了Fos在SCs亚群中的表达。额外的实验也显示，酶解的时间影响了亚群体2特定基因的表达水平（图c）。作者也证实了解离方案确实影响了SCs的转录组，亚群2实际情况可能并不存在于未损伤的肌肉中。于是作者更新了分析算法，结合FACS分选后的转录组测序数据，有效识别和去除了SCs受解离影响的细胞群(图d、e）。
另外，作者对之前其他单细胞研究中，如小鼠腺泡细胞、斑马鱼鳍成骨细胞亚群中也发现了类似的IEG和HSP的表达。综合所有论据表明，热酶解的分离方案可能会在跨组织间，甚至跨物种间引发类似的问题。
Adam M, et al. 2017和Denisenko E,et al. 2020分别研究了肾脏在“热解离”和“冷解离”两种方式下的单细胞测序结果的差异，具体研究内容如下：
Case1
Adam M, et al. 2017比较了新生小鼠的肾脏在两种解离条件下（37℃酶解和6℃冷蛋白酶解）的单细胞数据结果，表明低温解离法有效避免热酶法导致基因表达模式的人为改变（Artifactual Changes），“冻结”（‘freezing in’）了体内应激基因的表达。
1、研究背景
目前的单细胞测序存在三大限制：
1）检测基因的表达容易受到瞬时状态的扰动；
2）大多数技术只能检测到实际存在的5-50%的mRNA分子，RNA检出率有待提高；
3）通常组织解离所使用的酶和酶混合物包括胰蛋白酶、TrypLE、链霉蛋白酶、胶原酶、Liberase酶和Dispas酶等都在37°C时具有活性。在这个温度下，哺乳动物细胞内的酶也具有最大的活性，必然会引起基因表达的人为变化。
嗜冷或嗜低温生物能够适应在寒冷环境中生存，这些生物可以产生适应在寒冷中具有高活性的蛋白酶。单细胞RNA-seq可以结合使用在低温下显示高活性的冷适应蛋白酶，那么整个组织解离过程在冰上或者低温环境下进行，在这个温度下，哺乳动物的酶几乎没有活性，从而减少基因表达的干扰。
作者开发并测试了一种单细胞解离的冷蛋白酶方法，应用于出生后第1天(P1)的新生小鼠肾脏的单细胞测序，结果表明它可以显著减少37°C蛋白酶孵育产生的基因表达人为变化。
2、研究方法
研究对象：新生CD1小鼠肾脏
冷解离：使用地衣芽孢杆菌蛋白酶（冷蛋白酶，NATE0633）在6℃水浴孵育进行组织解离
热解离：使用2型胶原酶（Worthington）和链霉蛋白酶E（Sigma, P6911）在37℃孵育进行组织解离，为了探究孵育时间造成的影响，孵育时间分为15min、30min和60min三个组。
3、研究结果和结论
①冷解离法显示了良好的分离细胞能力
单细胞测序共拿到共20,424个细胞，包括冷解离法4853个细胞；热解离法中，孵育15min组5261个细胞，孵育30min组5870个细胞，孵育60min组4440个细胞，冷解离法和热解离法显示了相同的细胞分类。足细胞是章鱼状的细胞，紧密地包裹着肾小球的毛细血管，特别难以分离。结果观察到冷解离法良好的足细胞检出率，表明冷解离法具有较好的分离细胞能力。
②热解离法引入基因表达模式的改变
即时早期反应基因（IEGs，Immediate-Early Response Genes）是在37°C时的单细胞解离过程中改变表达的主要候选基因，包括有丝分裂基因、生长因子和应激基因等，Fos和Jun家族基因是典型的即时早期基因，这些基因会被环境因素迅速诱导表达。热解离法显示出非常高的即时早期反应基因的表达状态，而冷解离法中这些基因表达量极低，有些基因表达水平两种方法差异达到了上千倍。表明热解离法引入基因表达模式的改变，而冷解离法较好地维持了基因表达的稳定。
Case2
Denisenko E,et al. 2020系统评估了不同解离方法、细胞保存方式对scRNA和snRNA数据结果的影响，这其中就涉及到37℃热解离和4℃冷解离两种方式对肾脏解离结果的差异，包括细胞组分和基因表达层面的差异。
1、研究背景
实体组织需要解离后获得高质量细胞悬液，最佳的解离效果既要满足释放难以解离的细胞类型，同时也要避免伤害脆弱细胞。组织单细胞悬液制备最常用的方法是37℃酶孵育解离的方法。在这个温度下，细胞转录活跃，因此解离过程基因表达可能会发生改变。最小化降低引入基因表达差异的替代方法是使用冷活性蛋白酶，在冰上进行组织解离。另外，单细胞核RNA测序 (snRNA-seq)可以利用冷冻组织组织解离释放细胞核，从而避免了许多解离诱导的影响，同时单细胞核测序也可以解决大直径细胞无法直接进行scRNA-seq的困扰。另外在实际操作中，往往面临着不能立即处理标本的情况，需要将样本以组织组织或单细胞悬液的形式保存（甲醇固定和冷藏保存）。
以上不同处理方法都会引入了特定的偏差和影响，因此在设计和分析单细胞实验数据时，需要考虑到这些影响。然而，对于不同处理方法的影响目前还是不清晰的，因此作者使用健康成年小鼠肾脏进行了一项综合研究：使用10x Genomics开展scRNA-seq和snRNA-seq，同时开展了未解离和解离组织的常规RNA-seq。单细胞测序比较了两种组织解离方法(37℃解离，称为热解离；4℃冷活性蛋白酶冰上解离，称为冷解离)、两种单细胞悬液保存方法(甲醇固定和冷冻保存)和三个单细胞核制备方法间的数据差异。
2、实验方法
研究对象：C57BL/6J小鼠的肾脏
热解离：使用美天旎Multi-tissue dissociation kit 2（130-110-203）于37℃下进行组织解离
冷解离：使用地衣芽孢杆菌酶（Sigma，P5380）在冰上（4℃）进行组织冷解离
细胞核分离：
细胞核分选方法1（FANS）：清洗细胞核三次，离心转速500g（SN_FANS_3x500g）；
细胞核分选方法2（FANS）：清洗细胞核一次，离心转速2000g（SN_FANS_1x2000g）；
方法3（Sucrose Gradient）：细胞核先500g自旋清洗，然后使用蔗糖缓冲液清洗
甲醇固定细胞：
组织解离后，细胞以1000g离心10分钟，浓缩至约5*106 cells/mL，取200ul细胞悬液等分装入置于冰上的2 mL冷冻管中，800ul 100%甲醇（-20℃冷冻）逐滴加入到样本中并轻轻搅动细胞以防止结块，冻存管在- 20℃保存30分钟，然后直接转移到- 80℃（无需梯度冷却）
低温保存细胞：
组织解离后，细胞以400g离心10 min（重复试验离心条件为4℃ 1200g离心5min），然后重悬在冷冻液中（50%胎牛血清、40% 1640培养液、10% DMSO)，调整细胞浓度至1*106 cells/mL。取1mL细胞悬浮液放入2mL的冻存管中，然后放入异丙醇冻存盒，-80过夜，第二天转移到液氮储存
3、实验结果和结论
①热解离会引起应激反应
解离后得到的细胞悬液做Bulk RNA-seq，在热解离样本中鉴定到71个上调基因，在冷解离样本中鉴定到5个上调基因。GO富集分析发现热解离样本的高表达基因显著富集到细胞死亡的调控，差异倍数最大的基因（log2FC>4）包括即时早期反应基因（IEGs，Immediate-Early Response Genes）Fosb、Fos、Jun、Junb、Atf3、Egr1和热休克蛋白Hspa1a、Hspa1b（图A），这些数据证实了（Adam M, et al. 2019）的结论，即热解离组织会导致应激反应相关基因的变化。
②不同细胞具有应激反应异质性
使用新鲜细胞悬浮液的scRNA-seq分析了热/冷两种解离方案的差异，共鉴定到15种细胞类型，包含23108个细胞，其中11,851个细胞来自冷解离，11,257个细胞来自热解离（图B）。差异分析发现，热解离样本有64个基因在至少一种细胞类型中高表达（图B），显著富集的GO是细胞死亡的调控，细胞中最常见的过表达基因包括即时早期反应基因，如Junb和Jund（在7种细胞中差异表达）以及Jun和Fos（在5种细胞类型中差异表达）（图D）。值得注意的是，不同细胞类型的差异表达基因的数量有所不同（图B），这表明细胞类型对热解离反应不同。选择17个已知的热解离诱导基因（Fosb, Fos, Jun, Junb, Jund, Atf3, Egr1, Hspa1a, Hspa1b, Hsp90ab1, Hspa8, Hspb1, Ier3, Ier2, Btg1, Btg2, Dusp1) 用于计算压力得分，在14种细胞类型中，有8种细胞类型的检测到显著的高压力分数（图C）。这些结果表明，某些细胞类型，如免疫细胞和内皮细胞，对热解离特别敏感。
冷解离样本中，有20个基因的高表达，其中只有5个基因（Hbb-bs、Hba-a1 Hba-a2, mt-Co1, Malat1）被确定在至少两个细胞类型中高表达（图B），另外发现，冷解离处理样本中存留血红蛋白转录本的污染比例更高。
③两种解离方案的细胞组成不同
除了基因表达变化之外，作者还鉴定了8个细胞群在热解离样本中含量变少，包括足细胞、系膜细胞和内皮细胞。这些衰竭细胞类型还显示出上述应激反应相关基因的显著高表达。值得注意的是，在热解离样本中只检测到3个足细胞(占总细胞的0.03%)，冷解离样本中足细胞数为330 (2.78%)。这些发现表明，足细胞、系膜细胞和内皮细胞等细胞类群对热解离很敏感。
而在冷解离样本中，肾脏亨利氏环(aLOH)和近端小管(PT)细胞数量变少（aLOH 4.99% in warm vs. 2.52% in cold；PT 71.36% in warm vs. 63.34% in cold），表明冷解离方式对aLOH和PT细胞分离效率相较于热解离方式偏低。
另外，Hochane M, et al. 2020研究人类胎儿5个发育阶段（9、11、13、16、18周）的肾脏单细胞图谱和基因表达动态，在肾脏组织解离方法中也采用了“冷解离”的方式：胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ混合酶于4℃孵育过夜进行肾脏组织消化，提示了“冷解离”方式的优越性。
O'Flanagan CH, et al. 2019比较了实体瘤（乳腺癌、卵巢癌）在“热解离”和“冷解离”两种解离方式、以及解离时间对基因表达变化的影响，确认了热解离或者解离时间过长均会诱导即时、热休克和应激反应基因等基因的表达，而冷解离能够减小这一影响。具体研究内容如下：
1、研究背景
scRNA-seq也受到技术局限和生物噪声的影响。转录的固有性质是短暂的和动态的，反映了细胞对环境的快速反应的能力。基因表达脉冲模式已被证明对scRNA-seq数据有显著的噪声干扰。实体组织的单细胞悬液标准制备方法需要酶解和机械解离，根据组织来源、密度、疾病状态、弹性蛋白或胶原蛋白的含量，可能需要长时间的酶消化和/或剧烈的机械解离。转录机制在37°C时仍然活跃，在高温下延长孵育时间可能会引入基因表达伪产物，这与组织收获时的生物学特性无关。此外，在缺乏营养物质或剧烈的解离情况下，在较高的温度下孵育，可能导致细胞凋亡或缺氧，污染活细胞群或产生低质量的细胞悬液。
因此，描述细胞分离方法对组织转录组的改变和潜在影响是非常必要的。Adam M, et al. 2017研究表明，从喜马拉雅冰川细菌地衣芽孢杆菌中分离出来的丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌素A)适用于4-6°C的非恶性肾组织解离，可以减少减少单细胞基因表达变化。鉴于肿瘤组织的异质性和复杂性，作者探究了乳腺癌、卵巢癌患者癌组织，乳腺癌患者来源的异种移植(PDXs)和癌细胞系，在37℃和6℃酶解条件下，以及30min，1h，2h，3h酶孵育时间对即时、热休克和应激反应基因等核心基因集的表达影响。
2、实验方法
研究对象：乳腺癌、卵巢癌患者癌组织，乳腺癌患者来源的异种移植(PDXs)和癌细胞系
热解离：胶原酶/透明质酸酶的混合酶在37℃孵育2h解离组织
冷解离：枯草杆菌素A（一种丝氨酸蛋白酶，来源于喜马拉雅土壤细菌地衣芽孢杆菌，NATE0633）在6℃孵育30min解离组织
3、实验结果和结论
①热解离引起应激基因的表达
在37°C和6°C消化组之间发现11,975个显著差异表达的基因，锁定了512个随着解离温度变化的核心基因集，其中507个在37°C组上调，其余5个下调。该基因集包括多个典型的应激相关基因，如FOS、FOSB、ATF3和热休克蛋白 (HSPs)等，被证明是37°C胶原酶消化时诱导产生的。通路富集分析显示，核心基因主要富集在缺氧、凋亡和炎症反应等应激相关通路。结果表明，37°C的热解离诱导了应激反应。
②消化时间影响应激基因的表达
为了探究上述应激基因的表达是由于胶原酶消化时间较长，还是由于酶本身诱导的，作者进行了时间过程实验，孵育时间分别设置为30min，1h，2h，3h。比较消化时间的差异，得到18734个显著基因，有420个（82%）的差异基因映射回上述512个核心基因中。综合上述结论表明，37℃热消化和过长的消化时间均会诱导应激基因表达。
Mattei D, et al. 2020研究了37℃酶消化(Enzymatic Digestion，ED)和4℃机械分离(Mechanical Dissociation，MD)两种方法对于小鼠脑海马区组织分离到的细胞，在细胞形态、细胞类型、基因表达、蛋白表达、表面标记物变化等情况进行比较，表明酶消化法导致脑细胞类型和基因表达的偏差，以及胞内蛋白和表面标志物的表达也发生改变。具体研究内容如下：
1、研究背景
从脑组织中获得单细胞悬液的主要技术是酶消化(Enzymatic Digestion，ED)和机械分离(Mechanical Dissociation，MD)。后者通常在4℃下进行，而前者需要在30-37℃之间的温度下孵育进行。虽然ED和MD都可能发生细胞丢失和细胞形态的变化，但我们假设可以控制在较低温度下进行，那就能减少对于细胞活率，细胞碎片和细胞质泄漏等情况的过度影响。另外，ED可能会对细胞的转录组和蛋白谱引入额外的偏差。在细胞代谢活跃的温度下，酶消化过程中，表面受体可能发生变化。因此，这可能会在细胞分选分析中引入额外的偏差，如荧光激活细胞分选(FACS)和飞行时间时的细胞术(CyTOF)。
目前ED是从脑组织中获得单细胞悬液最广泛的方法，ED是否对脑组织细胞的基因表达造成改变，以及是否对细胞表面蛋白引入偏差（如流式细胞术和质谱分析）？暂未知晓。作者设置了MD 4℃、ED 37℃两种分离条件下对小鼠海马组织分离后的细胞形态、细胞类型、基因表达、蛋白表达、表面标记物变化等情况进行比较，探究热酶解法对脑组织细胞、基因、蛋白这几个维度的影响。
2、实验方法
研究对象：小鼠脑海马区
热解离：酶解法，采用RPMI培养基、10%胎牛血清(FBS)、胶原酶和DNaseI的混合解离溶液在37℃孵育30min
冷分离：机械分离法，采用组织匀质器添加Hibernate-A培养基，4℃制备组织匀浆
3、实验结果和结论
①酶消化法导致脑细胞类型和基因表达的偏差
两种方式得到的细胞形态显示出差异，ED 37℃相较于MD 4℃细胞直径偏小（图a）。单细胞测序得到的细胞类型上看，ED 37℃相较于MD 4℃，会损失神经元和星形胶质细胞，而小胶质细胞会大量富集，显示了两种方式对获取细胞类型存在差异性（图b），而MD 4℃得到的细胞类型更接近于脑海马区真实的细胞组分。
ED 37℃和MD 4℃得到的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中，显示一系列差异基因（图a），涉及到RNA编辑、翻译、代谢功能，以及小胶质细胞免疫失调等功能基因。另外也发现小胶质细胞群体显示了即时早期基因Jun和Fos的表达。ED 37℃诱导了一个小胶质细胞群体的出现，其特征是即时早期基因的表达增加（图b上），而MD 4℃这类小胶质细胞中几乎不存在（图b下）。
②酶消化法导致脑细胞蛋白表达的偏差
重点关注星形胶质细胞和小胶质细胞蛋白质谱表达的变化，与基因表达情况相似。在小胶质细胞种，ED 37℃诱导的差异表达的蛋白涉及到细胞运动、内吞作用和免疫过程，以及与mRNA编辑、组蛋白修饰和染色质结构相关（图b）。在星形胶质细胞中，ED 37℃诱导了与各种代谢过程，以及翻译和转录修饰相关的蛋白的改变(图c)。结果表明，酶消化法导致脑细胞蛋白表达的偏差。
③酶消化法改变流式细胞术对经典小胶质细胞标记物的检测
作者比较了两种方法中常用的小胶质细胞标记物CD45、CD11b、SIRPα和FcγR1的相对表达水平。与MD 4℃相比，ED 37℃分离的细胞中CD11b、CD45和SIRPα的表面表达显著增加，FcγR1表达变化不大（图d-g）。当MD 4℃和ED 37℃细胞聚集在一起时，细胞内CD11b的表达是主要的鉴别因素(图4h)。这些结果表明，细胞分离方法可以影响流式细胞术分析中用于选择和研究小胶质细胞群的标记物指标。
综上所述，采用低温解离方案能够有效降低甚至消除由于37℃酶孵育带来的“转录偏差”，保证细胞数据结果的准确性。一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用“冷解离”的分离方式，但是“冷解离”对一些致密包裹的难解离细胞的分离效率可能会降低。研究人员需要根据组织和细胞的特性，综合评估分离效率、细胞耐受性、基因表达影响等因素，选择最优的解离方案！
附：“冷解离”实验方案（小鼠肝脏为例）
背景介绍
肝脏的主要连接成分是结缔组织，因此使用胰蛋白酶对肝脏进行第一轮解离；枯草芽孢杆菌蛋白酶可水解天然和变性蛋白，并且在低温碱性条件下具有活性，因此使用其对肝脏组织进行进一步解离。为了保存小鼠肝脏完整的基因表达谱，将成年小鼠肝脏置于冰上进行解离。小鼠肝脏第一层由0.25%胰蛋白酶在4 ℃下离解离10 min，第二层由添加地衣芽孢杆菌酶，胶原酶及DNAseⅠ组成的混合酶进行进一步解离。
试剂和耗材信息
实验步骤
1.在预冷的组织保存液中保存及运输组织，配制酶解离液，置于冰上待用，离心机调整至4℃预冷。
2.将放有1/2体积DPBS的培养皿置于冰上，使用无菌的剪刀及镊子剪切组织直至糊状。
3.使用DPBS对剪切的组织进行过筛清洗。
4.离心管中每30 mg肝组织中加入1 mL胰酶，通过摇晃试管重新悬浮组织颗粒，在室温下静置10 min。
5.在离心管中加入5 mL预冷的DPBS，稀释胰蛋白酶混合液，终止消化。
6.在离心机中使用250 g 4℃离心5 min后，除去上清液。
7.在离心机中加入4 mL预冷的DPBS重悬细胞核组织，在冰上沉淀1 min使大组织块沉降（释放的细胞留在上清液中）。
8.将收集的上清液（含细胞）通过40 µm细胞筛过滤，去除结团细胞及组织块。
9.过滤后的细胞悬液通过4℃ 300 g离心5 min收集后使用0.5 mL的PBS（含1% BSA）重悬细胞，置于冰上保存。
10.将步骤7中剩余的组织块中加入组织解离酶（5 mg/mL，胶原酶IV 0.8 mg/ml，DNAse I 0.5 mg/ml），置于37℃的摇床上80 rpm/min进行解离。
11.消化 8-12 min之后，加入两倍体积的DPB稀释终止消化，取出离心管，涡旋仪上，轻微涡旋2-3次（2S/次）。
12.将终止消化后的酶及细胞混合物分别通过70μm和40μm的细胞筛，离心收集细胞。
13.在4 °C下旋转300g离心5 min，除去上清液，使用DPBS（含1% BSA）重悬细胞，置于冰上备用。
14.将步骤9，步骤12中的细胞离心收集，加入1 -4 mL红细胞裂液，置于冰上3-5 min裂红。
15.裂红结束后加入等体积的DPBS, 在4 °C下, 300 g 离心5 min 收集细胞。
16.去除上清液后，使用含有0.5% BSA的DPBS重悬细胞，用AO/PI染料染色计数。
结果展示
解离产率为5000 cells/mg组织，细胞存活率大于等于93%（以AO/PI计数为标准）。
注意：肝脏组织中杂质及碎片较多，且肝细胞容易破裂（酶耐受性比较差），所以解离过程中要注意根据实际情况适当下调富集细胞时的离心力，达到彻底清洗碎片和杂质的目的。在解离过程中使用的解离酶，浓度和强度不宜过高，获取的单细胞悬液如果用于单细胞测序则需要在获取细胞悬液之后尽快进入下游建库，避免因细胞破裂造成RNA污染，从而影响整体测序数据质量。
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